Маликова Дарья Владимировна

Квалификационная работа магистра: "Участие метилтрансферазы Set 7/9 в регуляции репарации ДНК и контроле клеточного цикла в клетках человека"

Аннотация:   С каждым годом уровень заболеваемости злокачественными опухолями непрерывно растёт. Прогноз для больных раком зависит от множества факторов. Пока химиотерапия остаётся основным подходом в лечении онкологических больных. Основной целью исследователей является найти подходы, которые позволили бы снизить риски, ассоциированные с применением химиотерапевтических препаратов, и повысить эффективность лечения. На данный момент, наиболее привлекательным решением рассматривают выявление ключевых белков, нарушение функций которых приводит к канцерогенезу, и направленная их модуляция позволит достичь успеха в борьбе с раковыми заболеваниями. Лизин-метилтрансферазы играют фундаментальную роль в регуляции биологических процессов. Нарушение функций метилтрансфераз приводит к серьёзным изменениям в клетке, часто являющимся причиной опухолеобразования. В последнее время изучению лизин-метилтрансфераз уделяется большое внимание, особенно в контексте регуляции негистоновых белков. Одной из ключевых лизин-метилтрансфераз является Set 7/9. Она осуществляет метилирование негистоновых белков, которые вовлечены в контроль клеточного цикла и репарации ДНК. Данная работа посвящена изучению роли лизин-метилтрансферазы Set 7/9 в регуляции клеточного цикла и репарации ДНК, наиболее хорошо изученными мишенями Set 7/9 являются p53 и E2F1. Транскрипционный фактор E2F1 играет решающую роль в судьбе клетки, поскольку является регулятором клеточного цикла, репарации ДНК и апоптоза. Причиной возникновения большинства опухолей человека является нарушение экспрессии E2F1 или его регуляции. E2F1 подвергается метилированию при помощи Set 7/9. Как предполагается, регуляция E2F1 при помощи Set 7/9 определяет его функциональную активность. Таким образом, очень важно понять, каким образом осуществляется эта регуляция в раковых клетках человека. Знания о роли и функциях лизин-метилтрансфераз можно использовать в том числе для подбора правильной схемы терапии, или же в совокупности с другими биомаркерами в качестве прогностического критерия исхода лечения. В ходе данной работы было выяснено, что клеточные линии немелкоклеточного рака лёгкого различаются по продукции Set 7/9 и E2F1. Эти линии характеризуются различной чувствительностью к воздействию доксорубицина, одного из наиболее распространённых химиотерапевтических препаратов. Подавление экспресии Set 7/9 приводит к повышению числа двуцепочечных разрывов ДНК, что может свидетельствовать как о нарушении механизмов распознавания повреждений в молекуле ДНК так и о нарушениях в процессе их репарации. К тому же было выяснено, что Set 7/9 участвует в регуляции стабильности Mdm2 посредством модуляции активности Pcaf. В совокупности полученные данные подтверждают участие Set 7/9 в ответе клетки при повреждении ДНК.

Направление: Биология

Кафедра: Генетики и Биотехнологии

Научный руководитель:  Тентлер Д.Г., к.б.н.; Голубкова Е.В., к.б.н.

Отзыв

Дарья Владимировна Маликова начала работать в лаборатории «Биологии клетки в культуре» в Отделе клеточных культур ИНЦ РАН в 2010 году, будучи студентом 2-го курса Кафедры генетики и биотехнологии Биолого-почвенного факультета СПБГУ. В течение короткого времени, Дарья Владимировна овладела базовыми методами молекулярной биологии и стала активным участником выполняемых в группе проектов. Благодаря прекрасному образованию, полученному на Кафедре, Дарья Владимировна принимает участие во всех стадиях экспериментальной работы, от планирования экспериментов до оформления конечных результатов. За время выполнения бакалаврской и магистерской дипломных работ она овладела целым рядом современных молекулярно-биологических методов, таких как фракционирование клеточных компартментов, молекулярное клонирование, работа с клеточными культурами, трансфекция клеток человека плазмидной ДНК и shРНК, иммуноблоттинг, количественный и качественный иммунофлуоресцентный анализ и др. При выполнении проектов Дарья Владимировна способна с успехом адаптировать данные методики к конкретным экспериментальным задачам.
Таким образом, за время работы Дарья Владимировна Маликова выросла в самостоятельного исследователя, способного оценить стоящую перед ней научную проблему, исследовать имеющуюся литературу по данному вопросу, выбрать оптимальный путь ее решения и осуществить все необходимые эксперименты. Кроме того, Дарья Владимировна легко находит общий язык с коллегами, что позволяет ей с успехом работать в группе. После окончания СПБГУ и получения степени магистра, Дарья Владимировна рекомендована к поступлению в аспирантуру ИНЦ РАН под руководством Дмитрия Генриховича Тентлера.
 

Рецензент: д.б.н. Самбук Е.В.

Рецензия

Магистерская диссертация Маликовой Дарьи Владимировны посвящена одной из самых актуальных проблем – проблеме предотвращения онкологических заболеваний и борьбы с ними. Важнейшую роль в онкогенезе играют лизинметилтрансферазы, нарушение функций которых может приводить к развитию опухолей. Фермент  Set7/9 метилирует  и активирует транскрипционный фактор E2F1, оба фактора вносят вклад в регуляцию ответа клетки на повреждение ДНК.
Магистерская диссертация Маликовой Д.В. изложена на 65 страницах машинописного текста, иллюстрирована 2 таблицами и 16 рисунками и оформлена в традиционном стиле. Работа включает следующие разделы:  введение, цели и задачи, (2 стр.), обзор литературы (24 стр.), материалы и методы (5 стр.), результаты (12 стр.) и обсуждение (5 стр.). Выводы (3) изложены на 1 странице. Список литературы включает 107 работ, из них 2 на русском языке. Список сокращений отсутствует.
Во введении автор рассматривает основную проблему работы – вклад метилтрансферазы Set7/9 в репарацию ДНК и регуляцию клеточного цикла, решаемую на модели клеточного рака легких.  Для достижения цели сформулированы 4 задачи.
Обзор литературы в основном посвящен механизмам регуляции ответа клетки на повреждение ДНК. В обзоре подробно рассматриваются механизмы репарации двунитевых разрывов ДНК, а также сигнальные пути, регулирующие их активность. Подробно обсуждается роль факторов р53, Е2А1 и их посттрансляционных модификаций в реализации ответа клетки на повреждение ДНК. Обсуждается вклад лизинметилтрансфераз в канцерогенез. В заключение рассматриваются проблемы химиотерапии онкологических заболеваний. Обзор свидетельствует о хорошем знании литературы, содержит новейшие сведения и читается с большим интересом.
Глава «Материалы и методы» включает подробное и исчерпывающее описание всех использованных автором методик, культур клеток и условий их культивирования, а также методических подходов к решению поставленных задач и, безусловно, свидетельствует о хорошей методической подготовленности автора. Обилие разнообразных методов, освоенных автором – впечатляет.
В главе «Результаты» представлены полученные автором данные. В разделе 4.1. оценивается уровень белков: лизинметилтрансферазы Set7/9, транскрипционного фактора E2F1, а также киназ АТМ и ATR. К этому разделу возникает следующий вопрос.
Как экспрессируется ген, кодирующий киназу АТМ в нормальных клетках и раковых? Почему эта важная сигнальная киназа отсутствует во всех использованных линиях, является ли это причиной их перерождения? Кроме того, следовало бы оценить, количество этих белков.
В следующем разделе автор подбирает дозы доксорубицина, ингибитора топоизомеразы, и оценивает количество двунитевых разрывов ДНК и интенсивность флюоресценции фокусов H2AX. К этому разделу есть два вопроса: О чем свидетельствует интенсивность флюоресценции фокусов H2AX? На чем основан вывод о координированной работе белков Set7/9?
 Автором изучена зависимость чувствительности клеток к повреждению ДНК от уровня белка Set7/9, а также возможность влияния этого фактора на Mdm2 и Pcaf.
В разделе Обсуждение подробно, с привлечением данных литературы, раскрывается роль метилтрансферазы Set7/9 в эпигенетической регуляции экспрессии генов при раковых заболеваниях.
Выводы представлены в количестве 3. По мнению рецензента, первый вывод все-таки
не вполне доказан. 
Список литературы не вполне соответствует принятым стандартам. Литература не пронумерована, отсутствуют некоторые ссылки (Lewis, 2000; Malumbres, 2009; Elledge, 2000; Honda, Yasuda, 2009) . Самое большое количество замечаний к оформлению работы (в работе содержится большое количество опечаток, лабораторного жаргона «простое склеивание концов», «сращивание концов», лизинметилтрансфераза написано то через дефиз, то слитно, и т.д., много стилистических ошибок).
В целом работа Маликовой Д.В. имеет не только фундаментальное, но и практическое значение, так как лизинметилтрансферазы можно использовать для подбора правильной схемы химиотерапии, или же в совокупности с другими биомаркерами в качестве прогностического критерия исхода лечения.

Несмотря на сделанные замечания, магистерская диссертация Маликовой Дарьи Владимировны  « Участие метилтрансферазы Set7/9 в регуляции репарации ДНК и контроле клеточного цикла в клетках человека» содержит важные научные результаты, представляющие как теоретический, так и практический интерес, соответствует требованиям, предъявляемым к магистерским диссертациям и заслуживает оценки «отлично».

Дата защиты: 16-06-2015