Руженкова Юлия Сергеевна
Квалификационная работа магистра: "Молекулярно-цитогенетические особенности полиморфных гетерохроматиновых районов метафазных хромосом в клетках трофобласта человека"
Аннотация: Традиционно считалось, что районы конститутивного гетерохроматина (ГХР) являются конденсированными в течение всего клеточного цикла, поздно реплицирующимися, гиперметилированными и транскрипционно инертными, а также играют роль в поддержании архитектоники ядра, участвуют в процессах рекомбинации и регуляции экспрессии генов. Однако функции гетерохроматина в эмбриогенезе человека остаются малоизученными. Особый интерес представляет сателлитные ДНК крупных гетерохроматиновых блоков хромосом 1, 9, 16 и Y человека, полиморфизм которых до сих пор пытаются связать с патологией развития, однако, однозначных результатов по этому вопросу к настоящему моменту не получено. Кроме этого, в последнее время появляется все больше данных, свидетельствующих об особой организации гетерохроматиновых районов хромосом в цитотрофобласте хориона и плаценты, при этом была обнаружена транскрипция сатДНК на ранних стадиях эмбриогенеза. В качестве перспективных моделей для изучения транскрипции можно рассматривать органные культуры хориона, а также культуры нормальных и малигнизированных клеток трофобласта, однако, недостаточно известно о характеристиках ГХР в условиях in vitro.
В связи с этим целью настоящей работы было определить особенности метилирования и конденсации сатДНК в районах 1q12, 9q12, 16q11.2 и Yq12 на метафазных хромосомах из нативных и культивированных клеток трофобласта. С помощью морфометрических и иммуноцитохимических методов мы показали, что в условиях in vitro особенности конденсации и метилирования районов локализации сатДНК являются хромосомоспецифичными, а также зависят от источника клеток трофобласта – цитотрофобласта нормального хориона или постоянной клеточной линии JEG-3, полученной из хорионэпителиомы. Особого внимания заслуживает выявленная кариотипическая гетерогенность клеток JEG-3, свойственная культурам малигнизированных клеток, а также нестабильность числа хромосом, в том числе утрата хромосом, содержащих крупные блоки сатДНК (Y-хромосомы и одной из копий хромосомы 9), при длительном культивировании (к 40-му пассажу), что необходимо учитывать в дальнейших исследованиях.
При культивировании клеток JEG-3 от 5-го до 40-го пассажа при относительно неизменной степени конденсации всех изученных ГХР отмечается постепенное снижение степени метилирования районов, более выраженное для района 1q12 и менее выраженное – для 16q11.2. В органной культуре нормального хориона уровень метилирования ГХР всех хромосом разнонаправлено меняется только в течение одного клеточного цикла в условиях in vitro (24 часа культивирования): увеличение метилирования в 1q12 и 9q12 и уменьшение – в 16q11.2 и Yq12. При этом ни в одном из случаев не было зарегистрировано появление в сатДНК в районах 1q12, 9q12, 16q11.2 и Yq12 5-гидроксиметилцитозина, который является промежуточным соединением при активном деметилировании.
Вследствие выраженной межиндивидуальной изменчивости и полиморфизма сатДНК при изучении механизмов регуляции ее транскрипции и структурно-функциональной организации ГХР в трофобласте необходима детальная характеристика молекулярного состава сатДНК и копийности хромосом-специфичных повторов сатДНК в каждом гомологе хромосом 1, 9, 16 и хромосоме Y, что пока невозможно, но является перспективным в дальнейшем. В целом наше исследование носит фундаментальный характер и приближает к пониманию структурно-функциональной организации метафазной хромосомы в зависимости от типа клетки и условий ее культивирования.
Направление: Биология
Кафедра: Генетики и Биотехнологии
Научный руководитель: д.б.н. Кузнецова Т.В.
Отзыв научного руководителя
Руженкова Юлия Сергеевна поступила в магистратуру биологического факультета Санкт-Петербургского государственного университета после окончания Новосибирского государственного университета. Экспериментальную часть магистерской диссертации выполняла в лаборатории пренатальной диагностики врожденных и наследственных болезней ФГБНУ «НИИ акушерства, гинекологии и репродуктологии им.Д.О.Отта».
С первых же дней работы Юлия Сергеевна проявила необходимые для цитогенетика работоспособность, увлеченность усидчивость, сосредоточенность, терпеливость, дотошность и пунктуальность. С завидной легкостью она в совершенстве овладела новым для себя комплексом стандартных и современных методов цитогенетики человека: методы приготовления препаратов хромосом (из культивированных клеток хорионэпителиомы, из ворсин хориона и из фрагментов эмбриональных органов, из ФГА-стимулированных лимфоцитов человека), основные и специальные методы дифференциальной окраски хромосом (QFH/AcD, RBA, Ag-NOR). Кроме того, она освоила иммуноцитохимические и молекулярно-цитогенетические методы анализа хромосом, включая различные варианты гибридизации in situ. Она успешно овладела всеми приемами микроскопирования, в том числе с использованием компьютерных систем анализа изображений и программ для кариотипирования.
Предложенная ей тема, связанная с изучением морфо-функциональных особенностей хромосом в эмбриогенезе человека, потребовала титанического труда по разработке новых методов для анализа эпигенетических маркеров на метафазных хромосомах из трофобластических и эмбриональных клеток. Однако поначалу нас преследовали сплошные неудачи. Многократные безуспешные эксперименты, отнявшие много времени, а также излишняя самокритичность существенно подорвали уверенность Юлии Сергеевны в собственных силах. Этому способствовало и отсутствие литературных данных, непосредственно касающихся темы работы, как в отечественных, так и зарубежных научных изданиях, которые должны были помочь в интерпретации полученных в очень сжатые сроки нетривиальных результатов. Вместе с тем, знание английского языка позволило ей приобрести в процессе поиска литературы необходимую для осмысления полученных результатов и видения перспектив дальнейших исследований теоретическую базу. Опыт, накопленный в процессе выполнения и оформления ВКР, несомненно, пригодится ей в будущем.
Ю.С.Руженкова обязательна, тактична, отзывчива, коммуникабельна, прислушивается к советам руководителя и старших коллег, что вызывает уважение и признание сотрудников лаборатории.
В настоящее время Ю.С.Руженкову можно считать вполне профессиональным специалистом, с богатым методическим арсеналом и теоретическими знаниями, которые позволят ей успешно заниматься как научными исследованиями, так и практической диагностической работой в любом из направлений цитогенетики человека (пренатальная и клиническая цитогенетика, онкоцитогенетика).
Рецензент: к.б.н. Дукельская А.В.
Рецензия
Проблема роли структурно-функциональных особенностей гетерохроматиновых районов генома в онтогенезе человека обсуждается специалистами самых разных областей медицинской генетики на протяжении почти сорока последних лет. Особый интерес для исследователей представляют крупные блоки гетерохроматина на хромосомах 1, 9, 16 и Y. Многократные попытки самых разных авторов связать полиморфизм по длине этих блоков и гетероморфизм гомологов по этим районам с пренатальной и постнатальной патологией развития у человека не привели к каким бы то ни было однозначным результатам. Роль этих участков хромосом в эмбриогенезе очень плохо исследована. Появившиеся в последние годы данные о специфической морфо-функциональной организации гетерохроматиновых районов хромосом 1, 9, 16, и Y в цитотрофобласте хориона и плаценты, с одной стороны, и обнаружение транскрипции прицентромерных гетерохроматиновых районов хромосом в эмбриональных и экстраэмбриональных клетках человека – с другой, послужили стимулом для проведения данного исследования.
Магистерская работа Руженковой Юлии Сергеевной построена по традиционному плану и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материал и методы, результаты, обсуждение, выводы, список литературы, включающий 75 названий, 15 из которых на русском языке и раздел приложение, содержащий 1 рисунок и 3 таблицы.
Во введении автор четко формулирует цель исследования и определяет конкретные задачи.
Обзор литературы демонстрирует эрудицию автора в вопросах структурно-функциональной организации гетерохроматиновых районов хромосом человека и животных. Автор не только анализирует широкий круг проблем, связанных с молекулярными и функциональными особенностями гетерохроматиновых районов хромосом, но и формирует собственную позицию по всем рассматриваемым вопросам. К этому разделу работы возник один частный вопрос: «чем принципиально, на взгляд автора, отличаются районы центромерного и прицентромерного гетерохроматина?»
Раздел «Материал и методы» написан подробно и производит сильное впечатление количеством молекулярно-цитогенетических методов, освоенных автором в ходе выполнения магистерской работы.
Раздел «Результаты» демонстрирует основные достижения автора, к которым относятся исследования кариотипических и молекулярных характеристик митотических хромосом клеточной линии хорионэпителиомы (JEG-3). Результатом этого исследования явилось описание композитного кариотипа клеток этой линии, локализация кластеров рибосомальных генов и оценка активности ядрышкообразующих районов хромосом. Безусловно, эта информация будет полезна при использовании линии JEG-3 как модели для изучения особенностей ранних этапов эмбриогенеза человека. Кроме того, были охарактеризованы морфо-функциональные особенности гетерохроматиновых районов метафазных хромосом 1, 9, 16 и Y из клеток трофобласта-цитотрофобласта нативных образцов и кратковременных органных культур хориона, а также клеток линии JEG-3.
Раздел «Обсуждение» написан очень четко и позволяет увидеть некоторые закономерности в очень большом объеме разноплановых данных описанных в разделе «Результаты». Здоровая критическая оценка экспериментальных данных и грамотная соотнесение их с фактами, известными из научной литературы, позволяет автору хорошо осознавать место своей научной работы в общей канве мировых исследований. Приятным дополнением к этой главе является раздел «Заключение», в котором еще раз проявляется стремление автора к логической завершенности своего труда.
«Выводы» обоснованы и хорошо подкреплены экспериментальным материалом. Некоторый «описательный» оттенок выводов связан с этапом, на котором находится данное исследование.
В заключение хочется отметить, что магистерская диссертационная работа Ю.С.Руженковой производит очень хорошее впечатление. Работа хорошо сформулирована и написана грамотным русским языком. Подкупает стремление автора к выстраиванию четких причинно-следственных связей. В результате работы получен ряд приоритетных данных и освоен широкий круг современных цитогенетических методов. Работа очень хорошо оформлена и, безусловно, отвечает всем требованиям, предъявляемым к магистерским диссертациям в СПбГУ, и заслуживает оценки «отлично».
Дата защиты: 16-06-2015
|
