Чирак Евгений Леонидович
Квалификационная работа магистра: "Антропогенные факторы формирования почвенного микробиома: данные секвенирования библиотек гена 16S рРНК."
Аннотация: Разнообразие микроорганизмов, служащих биоиндикаторами состояния почв сельскохозяйственного назначения, долгое время исследовали с помощью методов лабораторного культивирования. Появление новых технологий секвенирования ДНК позволило перейти к анализу не только культивируемых, но и некультивируемых почвенных бактерий и архей.
В качестве фона для изучения влияния агротехники на почвенный микробиом может, в частности, использоваться лесосведение с последующим посевом сельскохозяйственных культур, а также применение традиционной и органической технологии земледелия.
В связи с этим целью работы было изучение эффекта двух комплексных факторов лесосведения и использования двух техник земледелия на структуру почвенного микробиома.
Согласно результатам ПЦР в режиме реального времени, средняя численность бактерий в почве составляла 1,56·109 для поля с органическим земледелием (площадка А), 8,37·108 для поля, обрабатываемого по традиционной схеме земледелия (площадка В) и 2,19·109 для лесной почвы (площадка С). Численность архей была на три порядка ниже и составляла 2,41·106 (площадка А); 8,15·105 ( площадка В) и 1,37·107(площадка С).
В результате анализа микробных сообществ было обнаружены представители 22 бактериальных фил. Самыми распространёнными оказались филы Proteobacteria (57,9%), Acidobacteria (16,1%), Actinobacteria (7,9%), Firmicutes (4,8%), Verrucomicrobia (2,0%), и Bacteroidetes (2,7%)
С использованием матриц попарных дистанций, полученных на основе двух стратегий кластеризации ОТЕ (de novo и closed reference) в программе QIIME, проведен кластерный анализ. В обоих случаях микробиом лесной почвы образовывал кластер со 100%-ной поддержкой (по результатам теста jackknife). В то же время микробиомы площадок А и В образовывали кластеры только при использования алгоритма closed reference (в котором последовательности ОТЕ сравнивали с базами данных).
Направление: Биология
Кафедра: Микробиологии
Научный руководитель: д.б.н. Пиневич А.В., к.б.н. Андронов Е.Е.
Отзыв научного руководителя
Чирак Евгений Леонидович начал научную деятельность в лаборатории микробиологического мониторинга и биоремедиации почв ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии весной 2012 года, будучи студентом 4 курса СПбГУ. За время работы в лаборатории он успешно освоил спектр современных методов молекулярной биологии, используемых при анализе почвенной микробиоты, с применением техник высокопроизводительного секвенирования. Важной особенностью исследований в данной области является обширный биоинформатический анализ полученных экспериментальных данных, который может составлять до 90% времени работы. В этом направлении Евгений также успешно развивался, освоив один из наиболее популярных современных программных пакетов ‒ QIIME. Евгений отличается способностью к освоению новых подходов, исполнительностью и доброжелательностью. Мы надеемся на дальнейшее сотрудничество с Евгением.
Рецензент: к.б.н. С.Г.Аверина
Рецензия
Оценка состава микробных сообществ почвы и изменений, происходящих в них под влиянием антропогенной деятельности, в частности сельскохозяйственных мероприятий, в течение длительного времени осуществлялась с использованием классических методов лабораторного культивирования. Новые технологии секвенирования ДНК позволяют более полно описать микробиом почвы, выявляя как культивируемые так и некультивируемые почвенные бактерии и археи, а также проследить изменения в их составе. Поэтому, работа Чирака Е.Л., посвященная изучению влияния антропогенных факторов на формирование почвенного микробиома путем анализа секвенированных библиотек гена 16S рРНК, является актуальным исследованием.
Работа Е.Л. Чирака объемом 60 стр. построена по традиционному плану. Объемный список литературы содержит 141 работу, 136 из них - на английском языке. Во Введении автор обосновывает выбор темы, формулирует цель и задачи работы: изучить эффекты двух комплексных факторов – лесосведения и использования двух техник земледелия – на структуру почвенного микробиома.
Раздел «Обзор литературы» (23 стр.) посвящен характеристике разнообразных (классических и современных молекулярных) методов исследования почвенного микробиома. Подробно рассматриваются преимущества и проблемы, возникающие при анализе данных высокопроизводительного секвенирования. Анализируются данные по биоразнообразию почвенных микроорганизмов, полученные с использованием молекулярных методов: в частности, проводится сравнение сообществ в зависимости от типа и биогеографии почв, а также от характера антропогенного воздействия. Качество изложения материала в этом разделе свидетельствует о том, что автор серьезно проанализировал данные литературы по интересующему его вопросу.
В разделе «Материал и методы» (6 стр.) описаны места сбора проб почвы, порядок формирования средней пробы, приведены данные агрохимического анализа полученных образцов (однако не упоминается где и кем был выполнен этот анализ). Детально описаны процедуры выделения ДНК из почвы, количественной оценки содержания бактерий и архей методом ПЦР в реальном времени, пиросеквенирования ампликонных библиотек гена 16S рРНК и обработки полученных данных. Содержание раздела позволяет сделать вывод том, что используемые автором методы адекватны и подходят к решению поставленных задач.
Содержание раздела «Результаты» (9 стр.) свидетельствует о том, что автор справился с поставленными задачами. Полученные в ходе выполнения работы данные оформлены в форме гистограмм и таблиц, которые позволяют автору упростить подачу достаточно объемного материала. Автору удалось определить размер, структуру и степень биоразнообразия сообществ почвенных микроорганизмов в пробах, и оценить влияние типов землепользования на микробиом почвы.
В главе «Обсуждение результатов» (4 стр.) автор подробно анализирует полученные данные, приходя к выводу о том, что изменение типа землепользования от лесоразведения к земледелию приводит к снижению общей численности и биоразнообразия в сообществах почвенных микроорганизмов. Отмечено преобладание определенных систематических групп микроорганизмов в отдельных пробах (например, копиотрофов р. Pseudomonas – в пахотных почвах или олиготрофов р. Burkholderia – в лесной почве), которое автор связывает с различиями в агрохимических показателях образцов почвы.
Итоги проведенных исследований оформлены автором в заключении и выводах, которые достаточно четко сформулированы и полностью соответствуют полученным результатам.
При ознакомлении с работой у рецензента возникли некоторые замечания и вопросы:
1. Остается неизвестным источник данных агрохимического анализа.
2. В работе указано время отбора проб почвы, но сроки внесения удобрений неизвестны. Ведь в зависимости от периода времени, прошедшего после внесения удобрений, количественный и качественный состав сообщества почвенных микроорганизмов может меняться.
3. Простое определение состава сообщества почвенных микроорганизмов, поведенное в данной работе, к сожалению, не дает представления об уровне физиологической активности его отдельных членов. Какие современные подходы в исследованиях позволят, по мнению автора, восполнить этот пробел?
Однако, несмотря на высказанные замечания, работа Е.Л. Чирака в целом произвела благоприятное впечатление на рецензента. Работа полностью соответствует требованиям, предъявляемым к магистерским диссертациям. Считаю возможным оценить данную работу на «отлично».
Дата защиты: 16-06-2015
|
